• 生物活性

靶点及简介 ：JNK inhibitor, selective and irreversible

JNK-IN-8是第一个，不可逆的JNK抑制剂，作用于JNK1， JNK2和JNK4，IC50分别为4.7 nM， 18.7 nM和1 nM，比作用于MNK2， Fms选择性高10倍以上，对c-Kit， Met， PDGFRβ没有抑制作用。

体外研究

    JNK-IN-8抑制c-Jun的磷酸化，c-Jun是JNK激酶的直接底物。 JNK-IN-8抑制HeLa和A375细胞中的c-Jun磷酸化，EC50分别为486nM和338nM。 JNK-IN-8还具有基于KinomeScan和酶谱分析的出色选择性。累积这些组合的分析技术表明，JNK-IN-8和JNK-IN-12都是非常具有选择性的共价JNK抑制剂，适用于询问JNK依赖的生物现象[1]。 JNK-IN-8是一种选择性pan-JNK抑制剂，被发现通过使用KinomeSca方法基于伊马替尼结构的丙烯酰胺激酶抑制剂文库的广碱基激酶选择性分析来抑制JNK激酶。 JNK-IN-8相对于伊马替尼具有1,4-二苯胺和1,3-氨基苯甲酸亚结构的独特区域化学，并使用N，N-二甲基丁烯酸actemide弹头共价靶向Cys154。 JNK-IN-8采用L形I型结合构象进入位于ATP结合位点唇部的Cys 154 [2]。

激酶实验

    将A375细胞用1μMJNK-IN-8预处理指定的时间量。取出培养基，用PBS洗3次。用1mL裂解缓冲液（1％NP-40,1％CHAPS，25mM Tris，150mM NaCl，磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物）重悬细胞沉淀。在4°C下端对端旋转30分钟。通过在Eppendorf中以14000rpm离心15分钟来澄清裂解物。使用Bio-Rad 10DG柱将澄清的裂解物凝胶过滤到激酶缓冲液（0.1％NP-40,20mM HEPES，150mM NaCl，磷酸酶抑制剂混合物，蛋白酶抑制剂混合物）中。凝胶过滤的裂解物的总蛋白质浓度应为约5-15mg / mL。用来自ActivX的探针以5μM标记细胞裂解物1小时。用DTT还原样品，用碘乙酰胺封闭半胱氨酸并凝胶过滤以除去过量的试剂并交换缓冲液。加入1倍体积的2X结合缓冲液（2％Triton-100,1％NP-40,2mM EDTA，2X PBS）和50μL链霉抗生物素蛋白珠浆液，端对端旋转2小时，以7000转/分钟离心2分钟分钟。用1X结合缓冲液洗涤3次，用PBS洗涤3次。向珠子中加入30μL1X样品缓冲液，在95°C加热样品10分钟。在110V的SDS-PAGE凝胶上运行样品。转移后，用JNK抗体[1]对膜进行免疫印迹。

细胞实验

    稳定表达白细胞介素受体1（HEK293-IL1R）的HEK-293细胞在补充有10％FBS，2mM谷氨酰胺和1x抗真菌/抗生素溶液的Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM）中培养。将细胞在与DMSO或JNK-IN-8温育前血清饥饿18小时，用2μMAnisomycin刺激1小时，并通过在16000g和4℃下离心10分钟澄清裂解物[1]。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Zhang T, et al. Discovery of potent and selective covalent inhibitors of JNK. Chem Biol. 2012 Jan 27;19(1):140-54.

[2]. Liu Q, et al. Developing irreversible inhibitors of the protein kinase cysteinome. Chem Biol. 2013 Feb 21;20(2):146-59.

• 溶解度及制备方案
  
  

DMSO (warmed with 50ºC water bath)	100 mg/mL (197.01 mM)
Water	Insoluble
Ethanol	Insoluble

储备液配制

Concentration / Solvent Volume / Mass	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	1.9701 mL	9.8505 mL	19.7009 mL
5 mM	0.394 mL	1.9701 mL	3.9402 mL
10 mM	0.197 mL	0.985 mL	1.9701 mL

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