• 生物活性

靶点及简介 ：CHIR-99021是 GSK-3α/β 抑制剂， IC50 分别为 10 nM，6.7 nM。 抑制 GSK-3α/β 比同源物 CDC2 和 ERK2 高 500 倍。

CHIR-99021 (CT99021)是一种GSK-3α和GSK-3β抑制剂， IC50分别为10 nM and 6.7 nM。CHIR-99021作用于GSK-3比作用于其最接近的同系物CDC2和ERK2，及其他蛋白激酶选择性高500倍。此外，CHIR-99021只与一组22种药理相关的受体微弱结合，且对一组23种非激酶的酶几乎没有抑制活性。CHIR-99021作用于表达胰岛素受体的CHO-IR细胞，诱导糖原合成酶(GS)激活，EC50为0.763 μM。

体外研究：

CHIR 99021抑制人GSK-3β，Ki值为9.8 nM [1]。 CHIR 99021是一种小有机分子，通过竞争其ATP结合位点来抑制GSK3α和GSK3β。体外激酶检测显示CHIR 99021特异性抑制GSK3β（IC50 = ~5 nM）和GSK3α（IC50 = ~10 nM），对其他激酶的影响很小[2]。在CHIR-99021存在下，ES-D3细胞的存活率在2.5μM时降低24.7％，在5μM时降低56.3％，在7.5μM时降低61.9％，在10μMCHIR-99021时降低69.2％，IC50为4.9μM [3]。

体内研究：

在ZDF大鼠中，单次口服剂量的CHIR 99021（16mg / kg或48mg / kg）迅速降低血浆葡萄糖，给药后3-4小时最大降低近150mg / dl [1]。在照射前4小时给予CHIR99021（2mg / kg）一次，在14.5Gy腹部照射（ABI）后显着提高存活率。 CHIR99021处理显着阻断了隐窝细胞凋亡和p-H2AX +细胞的积累，并改善了隐窝再生和绒毛高度。 CHIR99021治疗通过阻断细胞凋亡来增加Lgr5 +细胞存活率，并且有效地防止Olfm4，Lgr5和CD44的减少早在4小时[4]。

激酶实验：

通过使用其His或Glu标签从SF9细胞中纯化激酶。纯化Glu标记的蛋白质，纯化His标记的蛋白质。激酶测定在96孔板中用适当的肽底物在300μL反应缓冲液中进行（50mM Tris-HCl，pH 7.5,10mM MgCl 2,1mM EGTA，1mM二硫苏糖醇，25mMβ-甘油磷酸盐，1mM的变化） NaF和0.01％牛血清白蛋白）。肽的Km值为1至100μM。将CHIR 99021或CHIR GSKIA加入3.5μLMe2SO中，然后加入ATP至终浓度为1μM。温育后，将三份100μL等分试样转移至含有100μL/孔50μMATP和20mM EDTA的Combiplate 8平板。 1小时后，用磷酸盐缓冲盐水冲洗孔5次，填充200μL闪烁液，密封，30分钟后在闪烁计数器中计数。所有步骤均为室温。抑制百分比计算为100×（抑制剂 - 无酶对照）/（Me2SO对照 - 无酶对照）[2]。

细胞实验：

使用MTT测定法在暴露于不同浓度的GSK3抑制剂三天后测定小鼠ES细胞的存活力。 MTT活性的降低是一种可靠的基于代谢的测试，用于量化细胞活力;这种减少与细胞活力的丧失相关。将2,000个细胞在含有LIF的ES细胞培养基中的明胶包被的96孔板上接种过夜。第二天，将培养基更换为不含LIF且血清浓度降低的培养基，并补充0.1-1μMBIO，或1-10μMSB-216763，CHIR-99021或CHIR-98014。不含GSK3抑制剂或DMSO的基础培养基用作对照。所有测试条件一式三份进行分析[3]。

动物实验：

大鼠[1]制备重量<140g的雄性Sprague Dawley大鼠的原代肝细胞，并在分离后1-3小时使用。将等份的1×10 6个细胞在1mL DMEM / F12培养基加0.2％BSA和CHIR 99021（口服16或48mg / kg）或对照中在12孔板中在低速振荡器上于37℃孵育30分钟。在富含CO 2的气氛中，通过离心收集并在缓冲液A加0.01％NP40中冷冻/解冻裂解;再次进行GS测定。小鼠[4]使用6-10周龄的小鼠。对C57BL / 6背景（F10）和Lgr5-EGFP（Lgr5-EGFP-IRES-creERT2）小鼠的PUMA + / +和PUMA - / - 同窝小鼠进行全身照射（TBI）或腹部照射（ABI）。在放射前4小时腹膜内（ip）注射2mg / kg CHIR99021或在放射前28小时和1小时/ 1mg SB415286注射小鼠。处死小鼠以收集小肠用于组织学分析和蛋白质印迹。在处死前，所有小鼠腹膜内注射100mg / kg BrdU。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Ring DB, et al. Selective glycogen synthase kinase 3 inhibitors potentiate insulin activation of glucose transport and utilization in vitro and in vivo. Diabetes. 2003 Mar;52(3):588-95.

[2]. Bennett CN, et al. Regulation of Wnt signaling during adipogenesis. J Biol Chem. 2002 Aug 23;277(34):30998-1004.

[3]. Naujok O, et al. Cytotoxicity and activation of the Wnt/beta-catenin pathway in mouse embryonic stem cells treated with four GSK3 inhibitors.BMC Res Notes. 2014 Apr 29;7:273.

[4]. Wang X, et al. Pharmacologically blocking p53-dependent apoptosis protects intestinal stem cells and mice from radiation. Sci Rep. 2015 Apr 10;5:8566.

• 溶解度及制备方案

DMSO	39 mg/mL (83.81 mM)
Water	Insoluble
Ethanol	Insoluble

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