• 生物活性

靶点及简介 ：inhibitor of α-ketoglutarate-dependent dioxygenases

一种稍弱的竞争性 α-酮戊二酸 (α-KG) 依赖性双加氧酶抑制剂,其 Ki 值为 10.87±1.85 mM。而L-Hydroxyglutaric acid 的 Ki 值为 0.628±0.036 mM。

体外研究：

    加入50mM和100mM的D-α-羟基戊二酸(D-2-HG)分别导致部分和几乎完全抑制CeKDM7A。为了进一步检查α-KG和D-2-HG之间的相互作用模式,将CeKDM7A与固定浓度(50mM)的D-2-HG和增加量的α-KG一起温育。在50mM D-2-HG和100μMα-KG的存在下观察到KDM7A对H3K9me2和H3K27me2肽的部分抑制。添加300μMα-KG能够逆转50mM D-2-HG对CeKDM7A的抑制,表明D-2-HG是针对CeKDM7A去甲基化酶的α-KG的弱竞争性抑制剂。 D-2-HG,Ki为10.87±1.85 mM,用于抑制KDM5B/JARID1B/PLU-1 [1]。 D-α-羟基戊二酸(R-2HG)增加秀丽隐杆线虫的寿命。 (R)-2HG与α-KG依赖性双加氧酶明显相互作用。在表达IDH1(R132H)的U87和HCT116细胞中,细胞内(R)-2HG水平比对照细胞高20-100倍。升高的(R)-2HG水平与用辛基(R)-2HG处理的细胞中发现的水平相当,并且报道了IDH1-突变肿瘤样品的水平[2]。

激酶实验

    为了测定人JHDM1A / KDM2A去甲基酶对H3K36me2的活性，首先通过将pET28a-JHDM1A转化到大肠杆菌BL21中获得His标记的JHDM1A，并且当细胞密度达到0.5OD600单位时，通过在30℃下加入1mM IPTG诱导蛋白质表达。通过超声裂解细胞，并使用Ni-NTA琼脂糖纯化His-JHDM1A融合蛋白。通过在组蛋白去甲基化缓冲液[50mM HEPES（pH 8.0），625μMFe（NH 4）中孵育2μg寡核小体，4μg纯化的His-JHDM1A和/或10-50mM D-2-HG进行组蛋白去甲基化测定。 2（SO4）2,0.1-0.5mMα-KG，2mM抗坏血酸盐]在37℃下2-3小时，通过加入SDS上样缓冲液终止反应，随后使用抗H3K36me2抗体通过蛋白质印迹分析。 。为了测量针对H3K9me2和H3K27me2的CeKDM7A去甲基化酶活性，使用两种合成的二甲基化肽H3K9me2 [ARTKQTARK（me2）STGGKA]和H3K27me2 [QLATKAARK（me2）SAPAS]作为底物。脱甲基酶测定在10μg酶，1μg肽在20μl缓冲液20mM Tris-HCl（pH 7.5），150mM NaCl，50μM（NH 4）2 Fe（SO 4）2,100μMα-KG存在下进行。 ，2mM Vc，10mM PMSF，3小时。通过C18 ZipTip使去甲基化反应混合物脱盐。为了检测2-HG的抑制作用，在加入其它反应混合物之前，将各种浓度的2-HG与KDM7A一起温育。通过MALDI-TOF / TOF质谱仪分析样品[1]。

细胞实验

    将U87细胞，HCT116IDH1（R132H / +）细胞和HEK293细胞接种在12孔板中，并在过夜温育后用指定浓度的每种化合物（例如，400和800μMD-2-HG）处理。收获后，用吖啶橙（AO）和DAPI染色细胞。基于NC3000测量的AO和DAPI荧光测量细胞数和活力[2]。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Xu W, et al. Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of α-ketoglutarate-dependent dioxygenases. Cancer Cell. 2011 Jan 18;19(1):17-30.

[2]. Fu X, et al. 2-Hydroxyglutarate Inhibits ATP Synthase and mTOR Signaling. Cell Metab. 2015 Sep 1;22(3):508-15.

• 溶解度及制备方案
  

  浓度  /  溶剂体积 /质量	1 mg	5 mg	10 mg
  1 mM	5.2062 mL	26.0308 mL	52.0616 mL
  5 mM	1.0412 mL	5.2062 mL	10.4123 mL
  10 mM	0.5206 mL	2.6031 mL	5.2062 mL
  50 mM	0.1041 mL	0.5206 mL	1.0412 mL