• 生物活性

靶点及简介 ：Adenylate cyclase activator

Forskolin是一种普遍存在的真核细胞腺苷酸环化酶（AC）激活剂，在细胞生理学研究中，常用来提高cAMP水平。Forskolin可以使膜，细胞或组织制备液中cAMP含量上升。Forskolin 不仅可以活化AC 而且可以与某些其它蛋白相互作用，包括葡萄糖转运蛋白和离子通道。Forskolin能够促进9种不同独立AC形式的活化，虽然对AC9效率有点低，这可以用于提供一种鉴定和量化G蛋白 (Gs)–AC复合物高亲和性结合位点的方法。

体外研究

    Forskolin（Fsk）是一种从Coleus forskholii中分离的天然二萜，通过其催化亚基直接激活腺苷酸环化酶（AC），以增加环腺苷一磷酸（cAMP）的细胞内水平[1]。 Forskolin（Fsk）影响人T细胞系的增殖，例如Kit 225和MT-2。 Forskolin处理以剂量依赖性方式抑制Kit 225和MT-2细胞的增殖，IC 50等于~5μMFsk。 Forskolin处理（10-100μM）使cAMPi水平增加〜基础水平的5至20倍，达到50-100μMForskolin之间的最大水平[2]。

体内研究

    Forskolin（Fsk）治疗的Mrp4 - / - 小鼠显示Ki67阳性和切割的半胱天冬酶3阳性EC数量增加，周细胞覆盖量显着减少，空袖数量减少。在暴露于从P7到P12的高氧（75％氧）的幼鼠中，Mrp4 - / - 小鼠显示未血管化的视网膜区域显着增加[3]。健康大鼠组的平均血糖为102.12±1.94 mg / dL，对照组为101.25±3.56，毛喉素组为103±2.08。数据显示，研究结束时葡萄糖水平在毛喉素组中较低，根据应用的统计学检验有显着差异（p = 0.03）[4]。

激酶实验

    对于Jak3激酶测定，将Fsk处理的MT-2细胞裂解，澄清，并使用Jak3抗体进行免疫沉淀。激酶反应在30℃下进行20分钟。对于PKA激酶测定，裂解未处理的MT-2细胞，并将Jak3免疫沉淀并与PAS珠结合。免疫沉淀的Jak3用激酶缓冲液（50mM Hepes-NaOH（pH 7.4），10mM MgCl 2,0.5mM EGTA，0.5mM DTT，20μg/ mL抑肽酶，10μg/ mL亮肽素，1μg/ mL胃蛋白酶抑制剂A）洗涤。与200μMATP和纯化的蛋白激酶A催化亚基（PKAc）一起温育，如图例中所示。激酶反应在32℃下进行30分钟，然后用冷激酶洗涤缓冲液剧烈洗涤珠子。对于使用重组Jak3的[γ-32P] ATP放射性标记的激酶测定，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000，用野生型（WT）Jak3或激酶死亡的Jak3K855A转染Hek293细胞。裂解细胞并用Jak3抗体免疫沉淀。将Jak3结合的PAS珠在冷裂解缓冲液中洗涤三次，然后用激酶缓冲液洗涤。通过向Jak3结合的PAS珠反应混合物中添加10μCi[γ-32P] ATP，10μM未标记的ATP和1μg纯化的PKAc来启动激酶反应。激酶反应在32℃下进行30分钟。将Jak3结合的PAS珠子在放射免疫测定缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 7.4,75mM NaCl，20mM EDTA，10mM EGTA，20mM Na 4 P 2 O 7,50mM NaF，20mM 2-甘油磷酸盐，1mM）中洗涤三次。对硝基苯磷酸盐，0.1％Triton X-100）和一次在激酶洗涤缓冲液中。通过加入2×SDS-PAGE样品缓冲液然后SDS-PAGE终止反应。从PVDF膜上切下考马斯可染色的Jak3条带并进行磷酸氨基酸分析[2]。

细胞实验

    将静止试剂盒225或MT-2细胞以每孔5×10 4个细胞接种到96孔板中。然后用1％DMSO（载体）或毛喉素在1,5,10,25,50和100μM浓度下预处理细胞1小时。用IL-2刺激细胞并在37℃下再培养20小时。对照细胞用1％DMSO处理20小时。在最后4小时的孵育期间，用[3H]胸苷以0.5μCi/200μL的浓度脉冲细胞。将细胞收获到玻璃纤维滤器上并使用液体闪烁计数进行分析[2]。

动物实验

    使用小鼠[3] C57BL / 6J小鼠。 Mrp4敲除小鼠，建立并反复与C57BL / 6J小鼠回交。在出生后第4天（P4）和第5天（P5）将毛喉素腹膜内注射入新生小鼠。注射DMSO的小鼠作为对照。处理的小鼠在P6处安乐死，并且分离它们的视网膜用于整装免疫组织化学（IHC）。首先测试不同浓度的毛喉素对存活率和视网膜脉管系统的影响，确定最佳浓度，P4时为1.0μg/50μL（0.3 mg / kg），1.5μg/50μL（0.5 mg / kg）在P5，用于比较WT小鼠和Mrp4缺陷小鼠之间的视网膜血管表型。大鼠[4]雄性Wistar大鼠，年龄10-14周龄，平均体重300g±50g，分为四组; 19实验诱导发展为糖尿病，8保持健康状态。糖尿病和健康大鼠均不接受Forskolin（对照），或每天6mg / kg的Forskolin，口服给药8周。在毛喉素治疗之前和之后，在每组中测定血糖水平。在确认存在糖尿病（诱导后三周）和指定治疗八周后两周测试糖尿病大鼠。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Robbins JD, et al. Forskolin carbamates: binding and activation studies with type I adenylyl cyclase. J Med Chem. 1996 Jul 5;39(14):2745-52.

[2]. Rodriguez G, et al. Forskolin-inducible cAMP pathway negatively regulates T-cell proliferation by uncoupling the interleukin-2 receptor complex. J Biol Chem. 2013 Mar 8;288(10):7137-46.

[3]. Matsumiya W, et al. Forskolin modifies retinal vascular development in Mrp4-knockout mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012 Dec 7;53(13):8029-35.

[4]. Ríos-Silva M, et al. Effect of chronic administration of forskolin on glycemia and oxidative stress in rats with and without experimental diabetes. Int J Med Sci. 2014 Mar 11;11(5):448-52.

• 溶解度及制备方案
  

DMSO	82 mg/mL  (199.76 mM)
Ethanol	82 mg/mL  (199.76 mM)
Water	Insoluble

• 制备储备液
  

Concentration / Solvent Volume / Mass	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	2.436 mL	12.18 mL	24.3599 mL
5 mM	0.4872 mL	2.436 mL	4.872 mL
10 mM	0.2436 mL	1.218 mL	2.436 mL

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