• 生物活性

靶点及简介 ：

PRMT5 inhibitor,EPZ015666,GSK3235025 是有口服活性的 PRMT5抑制剂，IC50 为 22 nM。Ki 为 5 nM，选择性比其它 PMTs 高 20,000多倍。

体外研究：

    用EPZ015666处理MCL细胞系导致SmD3甲基化和细胞死亡的抑制，IC50值在纳摩尔范围内[1]。 EPZ015666，一种有效的肽竞争性和SAM合作抑制剂，相对于其他甲基转移酶，对PRMT5具有> 10,000倍的特异性[2]。

体内研究：

    EPZ015666是口服生物可利用的并且适合于体内研究。我们对携带皮下Z-138和Maver-1异种移植物的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠进行了21天的功效研究，每天两次（BID）口服给药4个剂量组：每公斤25,50,100和200毫克体重（mg / kg）。在连续给药21天后，对动物实施安乐死，并分析血液和组织以确定甲基标记药效学和肿瘤生长抑制（TGI）之间的关系。在两种MCL模型中，EPZ015666在21天后显示剂量依赖性暴露和TGI。与载体治疗的肿瘤相比，在第21天测量的所有EPZ015666剂量组中的肿瘤显示出重量，体积和肿瘤生长的统计学显着差异。以200mg / kg BID给药诱导Z-138细胞中的肿瘤停滞，21天后具有> 93％TGI，而Maver-1细胞显示> 70％TGI。另外，使用Granta-519细胞系测试第三次MCL异种移植物，该细胞系是在第18天达到终点的快速生长模型，并且在200mg / kg组中显示出剂量依赖性功效，45％TGI。 EPZ015666在所有三种模型中都具有良好的耐受性，在200mg / kg剂量组中体重损失最小，没有其他临床观察[1]。

激酶实验：

    将EPZ015666从1,000至0.051nM连续稀释三倍，并点样到384孔聚丙烯V底微孔板中。将3H-SAM在测定缓冲液中连续稀释两倍，用于七浓度稀释系列，最高浓度为700nM（最终测定浓度）。通过添加4nM酶和40nM肽（两者的最终测定浓度）开始反应。将反应温育60分钟，并通过在测定缓冲液中加入10μL/孔的600μM未标记的SAM（最终测定浓度）来猝灭。对于肽竞争，EPZ015666从1,000至0.051nM连续稀释三倍，并点样到384孔聚丙烯V底微孔板中。将肽在测定缓冲液中连续稀释两倍，得到七峰稀释系列，最高浓度为480nM（最终测定浓度）。通过加入4nM酶和75nM 3H-SAM（两者的最终测定浓度）引发反应。将反应物温育60分钟，并通过在测定缓冲液中加入10μL每孔600μM未标记的SAM（最终测定浓度）来淬灭反应[1]。

细胞实验：

    线性/对数生长的培养细胞在2-20mL培养基中分裂成2×10 5个细胞/ mL的接种密度，这取决于生长期结束时所需的产量。将化合物在DMSO中稀释并加入到每个培养容器中，DMSO的最终浓度为0.2％。使细胞不受干扰地生长96小时。在每个处理期结束时，通过离心（5分钟，1,200rpm）收获细胞，并用PBS冲洗细胞沉淀一次，然后在干冰上冷冻，等待进一步处理。对所有MCL系进行长期增殖测定，根据每种细胞系的生长特征对初始接种密度稍作调整。所有测定均进行12天[1]。

动物实验：

    小鼠[1]雄性CD-1小鼠（25-40g; n = 6，每个时间点3只）用单剂量的EPZ015666以2mg / kg静脉尾静脉注射和10mg / kg口服强饲法给药，两种剂量均配制在20％NN-二甲基乙酰胺的水溶液中。将动物禁食过夜并在给药当天给药前称重。通过下颌下或眼眶后出血以预先指定的时间间隔（7个时间点）从动物中取出约30μL血液。对于最后一个时间点（24小时），在动物麻醉（70％CO 2：30％O 2）的同时通过心脏穿刺收集样品。将血液样品转移到K2-EDTA管中并置于湿冰上，然后在4℃（3,000g，15分钟）离心以在样品收集后30分钟内获得血浆。在蛋白质沉淀和LC-MS / MS分析之前，将血浆样品储存在-70±10℃。我们通过分析一系列含有100 ng / mL拉贝洛尔作为内标的对照血浆等分试样和1-3,000 ng / mL EPZ015666来构建标准校准曲线。分析中还包括四个级别的质量控制（3-2,400 ng / mL EPZ015666）。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Chan-Penebre E, et al. A selective inhibitor of PRMT5 with in vivo and in vitro potency in MCL models. Nat Chem Biol. 2015 Jun;11(6):432-7.

[2]. Kryukov GV, et al. MTAP deletion confers enhanced dependency on the PRMT5 arginine methyltransferase in cancer cells. Science. 2016 Mar 11;351(6278):1214-8.

• 溶解度及制备方案
  

  DMSO (50ºC 水浴)	76 mg/mL  (198.21 mM)
  Ethanol (50ºC 水浴)	39 mg/mL   (101.71 mM)
  Water	Insoluble

  
  

  制备储备液

  浓度  溶剂体积  质量	1 mg	5 mg	10 mg
  1 mM	2.6080 mL	13.0398 mL	26.0797 mL
  5 mM	0.5216 mL	2.6080 mL	5.2159 mL
  10 mM	0.2608 mL	1.3040 mL	2.6080 mL
  50 mM	0.0522 mL	0.2608 mL	0.5216 mL

  
  

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