• 生物活性

靶点及简介 ：AMPK inhibitor

BML-275(Dorsomorphin)是一种有效的，可逆的，选择性AMPK抑制剂，在无细胞试验中Ki为109 nM。BML-275对一些结构相关的激酶，包括ZAPK， SYK， PKCθ，PKA和JAK3没有显著的抑制作用。BML-275对AMPK活性的抑制几乎完全抑制了HT-29细胞中的自体吞噬的蛋白质水解作用。BML-275选择性抑制BMP I型受体ALK2，ALK3和ALK6，并因此阻断BMP介导的SMAD1/5/8磷酸化作用，靶点基因转录和成骨分化。Dorsomorphin(10 毫克/千克)在成年小鼠体内，降低肝杀菌肽表达的基础水平，并增加血清中铁离子浓度。Dorsomorphin(0.2 毫克/千克，静脉注射)显著减少LPS 处理的大鼠胸主动脉中VCAM-1 和 ICAM-1的表达。

体外研究

    在2DG应力下，用10μMDorsomorphin处理HT1080细胞2小时。免疫印迹分析显示，通过将HT1080细胞暴露于2DG，AMPK的催化α亚基的磷酸化水平增加，而当添加Dorsomorphin时，基础和2DG诱导的磷酸化水平明显降低。使用基于ELISA的测定系统测量细胞激酶活性证实，无论细胞培养条件如何，Dorsomorphin都会降低内源性AMPK活性[2]。

体内研究

    在24小时内施用Dorsomorphin导致总血清铁浓度增加60％。因此，Dorsomorphin治疗可有效降低成人小鼠铁调素表达的基础水平并增加血清铁浓度[3]。

激酶实验

    将HT1080细胞接种在24孔板（每孔2×10 4个细胞）中，并在存在或不存在葡萄糖或10mM 2DG的情况下用Dorsomorphin处理2小时。通过在6孔板中转染质粒DNA（pAMPKα1-wt，pAMPKα1-D168A和pcFlag作为对照），在24孔板中接种并用UPR抑制剂处理来制备过表达野生型和显性失活AMPKα1的HT1080细胞。用细胞裂解缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 7.5,250mM NaCl，10％甘油，0.5％NP-40,1mM EDTA，1mM EGTA，0.2mM PMSF，1μg/ mL胃蛋白酶抑制剂，0.5）裂解细胞。 μg/ mL亮抑酶肽，5mM NaF，2mM Na 3 Vo4,2mMβ-甘油磷酸盐，1mM DTT）。使用CycLex AMPK激酶测定试剂盒[2]测定对照样品（在正常生长条件下的载体或pcFlag）的相对AMPK激酶活性（重复测定的平均值±SD）。

细胞实验

    在存在或不存在10mM 2DG或1μg/ mL衣霉素作为应激源的情况下，用不同浓度的Dorsomorphin（0,0.3,1,3,10μM），Versipelostatin和苯乙双胍处理HeLa和786-O细胞。 h在96孔板中。对于组合研究，在存在或不存在10mM 2DG的情况下，用各种浓度的UPR抑制剂处理786-O细胞24小时。然后用新鲜生长培养基替换培养基，并将细胞再培养15小时。随后，将MTT添加到培养基中，并确定每个孔的吸光度。对于在葡萄糖戒断条件下的活力测定，在存在或不存在葡萄糖的情况下，在12孔板中用不同浓度的Dorsomorphin和苯乙双胍处理HT1080细胞18小时，接种在96孔板中的生长培养基中，然后培养。再添加MTT前48小时。通过将来自未处理细胞的每个对照吸光度设定为100％来计算相对细胞存活率（一式四份测定的平均值±SD）。使用等效线法[2]分析药物组合在产生80％细胞生长抑制（IC80）的浓度下的作用。

动物实验

    小鼠[3]在标准饮食中饲养的12周龄C57BL / 6小鼠通过尾静脉注射0.2g / kg葡聚糖或0.2g / kg铁 - 葡聚糖USP。葡聚糖仅注射载体，而铁 - 葡聚糖注射载体或Dorsomorphin（10mg / kg）。注射后1小时，杀死小鼠并将肝脏片段收集在500μLSDS-裂解缓冲液中并机械均化。通过SDS-PAGE分离20μL肝脏提取物并进行免疫印迹。使用来自机械均质化的小鼠肝脏的Trizol收获总RNA（注射后6小时，单次腹膜内剂量的Dorsomorphin（10mg / kg）或DMSO）。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Zhou G, et al. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J Clin Invest. 2001 Oct;108(8):1167-74.

[2]. Saito S, et al. Compound C prevents the unfolded protein response during glucose deprivation through a mechanism independent of AMPK and BMP signaling. PLoS One. 2012;7(9):e45845.

[3]. Yu PB, et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 2008 Jan;4(1):33-41.

[4]. Chen L, et al. Activating AMPK to Restore Tight Junction Assembly in Intestinal Epithelium and to Attenuate Experimental Colitis by Metformin. Front Pharmacol. 2018 Jul 16;9:761

• 溶解度及制备方案
  储备液配制

  DMSO (warmed with 50ºC water bath)	1 mg/mL (2.50 mM)
  Water	Insoluble
  Ethanol	Insoluble

Concentration / Solvent Volume / Mass	1 mg	5 mg	10 mg
1 mM	2.5032 mL	12.516 mL	25.0319 mL
5 mM	0.5006 mL	2.5032 mL	5.0064 mL
10 mM	0.2503 mL	1.2516 mL	2.5032 mL



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