• 生物活性

靶点及简介 ：

Inhibitor of PI3K isoform p110α， PIK-75 是一种 DNA-PK 和 PI3K 抑制剂，抑制 DNA-PK，p110α 和 p110γ，IC50 分别为 2, 5.8 和 76 nM。PIK-75 抑制 p110α 效果比抑制 p110β (IC50=1.3 μM) 高 200 多倍。在Ser773处功能特异性突变，也有效抑制DNA-PK，无细胞试验中IC50为2 nM。

体外研究：

    PIK-75还抑制p110δ，PI3KC2β，mTORC1，ATM，hsVPS34，PI3KC2α，mTORC2，ATR和PI4KIIIβ，IC50为510 nM，~1μM，~1μM，2.3μM，2.6μM，~10μM，~10μM，分别为21μM，~50μM。 PIK-75单独阻断L6肌管和3T3-L1脂肪细胞中的Thr308磷酸化，IC50值分别为1.2和1.3μM[1]。 PIK-75是一种竞争性p110α抑制剂，相对于底物磷脂酰肌醇（PI），与大多数其他PI3K抑制剂相反，后者在ATP位点或其附近结合。使用序列分析和抑制剂复合物与p110γ和p110δ同种型的现有晶体结构，鉴定了非保守氨基酸的新区域（区域2），其被假定参与PIK-75p110α选择性。使用鉴定的非保守氨基酸至丙氨酸的体外突变对区域2进行分析，表明Ser773是参与PIK-75结合的关键氨基酸，与野生型相比，IC50增加8倍。进行进一步的动力学实验以确定PIK-75对ATP和PI与p11αS773D突变体结合的动力学的影响。使用浓度为0,50,100和200nM PIK-75的一系列PI浓度估计活性。 PI的Km为11.2μM，而野生型酶的Km为7.0μM。 PIK-75的Ki估计为146 nM，比野生型酶（2.3 nM）的估计值增加64倍[2]。用递增浓度的PIK-75处理MIA PaCa-2和AsPC-1细胞48小时，并通过MTT测定法测定细胞活力。 PIK-75通过凋亡细胞死亡抑制胰腺癌细胞的增殖。亚微米浓度的PIK-75足以在48小时处理后抑制胰腺癌，MIA PaCa-2和AsPC-1细胞的增殖。 PIK-75还可以减少胰腺癌MIA PaCa-2和AsPC-1细胞的集落形成[3]

体内研究：

    PIK-75增强吉西他滨在体内的抗肿瘤作用。通过体内小鼠异种移植模型进一步证明了PIK-75 /吉西他滨组合的作用。携带MIA PaCa-2肿瘤的小鼠与吉西他滨（20mg / kg），PIK-75（2mg / kg）或两种药物的组合一起施用。由于PIK-75是一种可逆抑制剂，PIK-75每周给药5次，以确保维持足够的抑制作用。吉西他滨每周给药两次。吉西他滨或PIK-75可使肿瘤生长降至相似程度[3]

激酶实验：

    在50μL的20mM HEPES，pH 7.5和含有180μM磷脂酰肌醇的5mM MgCl 2中测定PI3K酶活性，通过加入100μMATP（含有2.5μCi的[γ-32P] ATP）开始反应。在室温下孵育30分钟后，通过加入50μL1MHCl终止酶反应。然后用100μL氯仿/甲醇[1：1（v / v）]和250μL2MKCl提取磷脂，然后进行液体闪烁计数。将抑制剂（例如，PIK75））在20％（v / v）DMSO中稀释以产生浓度与酶活性曲线的抑制，然后使用Prism版本5.00对Windows进行分析以计算IC50 [2]。

细胞实验：

    将MIA PaCa-2细胞维持在含有10％热灭活的胎牛血清（HI-FBS），2.5％马血清（HS）和100U / mL青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中。 AsPC-1细胞在补充有20％HI-FBS，100U / mL青霉素/链霉素和1mM丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中培养。每孔总共2,000个人胰腺癌细胞（MIA PaCa-2或AsPC-1）接种于96孔平底板中，然后用吉西他滨，单独PIK-75（0.1μM，0.3μM和1μM）处理）或两种具有指定浓度的药物的组合。在指定的时间，向每个孔中加入20μL的1mg / mL MTT的PBS溶液，并进一步温育~4小时。离心并除去培养基后，向每个孔中加入150μLDMSO以溶解甲crystals晶体。使用ELx808吸光度酶标仪在562nm处测量吸光度。未处理细胞的吸光度指定为100％，相对活细胞表示为该值的百分比[3]

动物实验：

    将与Matrigel混合的小鼠[3] MIA PaCa-2细胞（~1.7×10 6个细胞/小鼠）皮下注射到6周龄的雄性无胸腺裸（Foxn1nu）小鼠的胁腹中。将吉西他滨（50mg / mL）溶解在PBS中，并将PIK-75（20mg / mL）溶解在DMSO中。注射溶液在无菌水中制成10％的Cremophor EL和3％的聚（乙二醇）400。在给予化合物之前，将吉西他滨在PBS中进一步稀释，并将DMSO或PIK-75在注射溶液中进一步稀释，并通过0.2μm过滤单元灭菌。将这些稀释剂以1：1的比例混合并施用到小鼠的腹膜腔中。吉西他滨（20 mg / kg）或吉西他滨（20 mg / kg）/ PIK-75（2 mg / kg）组合每周给药两次，载体对照和PIK-75（2 mg / kg）每周给药5次。每周测量体重和肿瘤大小3次。计算肿瘤体积。

• 验证及参考文献

验证：

参考文献：

[1]. Knight ZA, et al. A pharmacological map of the PI3-K family defines a role for p110alpha in insulin signaling. Cell. 2006 May 19;125(4):733-47.

[2]. Zheng Z, et al. Isoform-selective inhibition of phosphoinositide 3-kinase: identification of a new region of nonconserved amino acids critical for p110α inhibition. Mol Pharmacol. 2011 Oct;80(4):657-64.

[3]. Duong HQ, et al. Inhibition of NRF2 by PIK-75 augments sensitivity of pancreatic cancer cells to gemcitabine. Int J Oncol. 2014 Mar;44(3):959-69.

• 溶解度及制备方案
  

  DMSO (50ºC水浴)	3 mg/mL   (6.14 mM)
  Water	Insoluble
  Ethanol	Insoluble

  
  

  制备储备液Preparing Stock Solutions

  Concentration / Solvent Volume / Mass	1 mg	5 mg	10 mg
  1 mM	2.21 mL	11.06 mL	22.11 mL
  5 mM	0.44 mL	2.21 mL	4.42 mL
  10 mM	0.22 mL	1.11 mL	2.21 mL
  50 mM	0.04 mL	0.22 mL	0.44 mL